Медведка
Домашняя страница Обратная связь Карта сайта



Современные методы диагностики туберкулеза

Современные методы диагностики туберкулеза

Методика борьбы с туберкулезом, как и с любым инфекционным заболеванием, направлена на прерывание путей передачи возбудителя, а также ликвидацию источников инфекции благодаря выявлению эпидемиологически опасных пациентов, выделяющие с мокротой микобактерии туберкулеза (МБТ), и их безотложное лечение. Поэтому ведущим методом диагностики туберкулеза является микробиологическое исследование для выделения возбудителя заболевания и выполнения теста медикаментозной чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Другие методы диагностики (клинические, рентгенологические, внутрикожные тесты и гамма интерферон тесты, морфологические методы) являются вспомогательными и неспецифическими и не позволяют подтвердить диагноз туберкулеза. Больной с подтвержденным случаем туберкулеза — это пациент, в которого выделены МБТ культуральным или молекулярно генетическим методом.

В Украине и всем мире в течение длительного времени золотым стандартом диагностики туберкулеза был культуральный метод выделения МБТ на плотной среде
Левенштейна Йенсена. Это высокочувствительный метод, который позволяет проявлять МБТ при наличии в 1 мл образца материала 100 микроорганизмов. Недостатком метода является то, что рост микобактерий наблюдается только через 4-10 недель (МБТ относится к микроорганизмам, что медленно размножаются и растут).

В случае отсутствия роста через 10 недель посев считается отрицательным, и пробирки
удаляют. При положительном результате проводят тест медикаментозной чувствительности, результат которого оценивают еще через 6 недель. Следовательно, диагностировать резистентность МБТ к противотуберкулезным препаратам можно было в лучшем случае через 10 недель. Все это препятствовало назначению правильного лечения, что, в свою очередь, приводило к распространению химиорезистентных форм туберкулеза.

На жидких питательных средах рост МБТ наблюдают на 2-5-й день. До появления автоматизированных систем использование жидких сред было значительно ограниченным из-за сложности их приготовления — в их состав обязательно входят свежая цитратная гемолизованная донорская кровь или нативная бычья сыворотка. Поэтому диагностические исследования и бактериологический мониторинг лечения проводили только на плотной среде Левенштейна Йенсена, что задерживало процесс подтверждения диагноза и получения результатов теста медикаментозной чувствительности.

Учитывая значительную продолжительность срока получения результата культурального исследования скрининговым методом выявления туберкулеза, во всем мире стало исследование мазка мокроты методом микроскопии за Цилем Нильсеном. В 1884 г. бактериологи Ф. Цель и Ф. Нильсен нашли способ окраски МБТ, используя их природное свойство стойкости к действию кислот и спирта, обусловленное их морфологическим составом. Этот метод и по сей день является основным для быстрого проявления туберкулеза.

Итак, с помощью метода микроскопии мазка обнаруживают кислотоустойчивые бактерии (КУБ), подавляющее большинство из которых МБТ (в исключительных случаях это могут быть микобактерии не туберкулезного комплекса). Мазок окрашивают карбол-фуксином Циля, под действием которого КУБ окрашиваются в ярко красный цвет, и исследуют под микроскопом. Если в окрашенном мазке содержится не менее 5 КУБ в одном поле зрения, вероятность высева микобактерий очень высокая. Чтобы выявить КУБ методом микроскопии, количество МБТ в 1 мл исследуемого материала должна составлять от 5 до 10 тыс. Преимуществом этого метода является скорость (2-3 ч) и невысокая стоимость. Ни один из существующих современных методов диагностики не может пока вытеснить микроскопию по показателю «стоимость - эффективность». Метод применяют как для диагностики туберкулеза, так и для определения эффективности лечения.

Количество КУБ в мазке (или колоний в пробирке при культуральном методе
исследования) в процессе антимикобактериальной терапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к антимикобактериальным препаратам.

Стремительное распространение мультирезистентного туберкулеза побудило мировое научное сообщество к разработке ускоренных методов микробиологической диагностики туберкулеза, основанных на культуральных исследованиях с использованием жидких сред, которые коренным образом изменили подходы к ведению пациентов с туберкулезом.

В 1998 году был полностью расшифрован геном M. tuberculosis. Расшифровка генома МБТ стала основой для развития и разработки молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза.

Выделение специфичных для генома M. tuberculosis нуклеотидных последовательностей ДНК используют при ПЦР обнаружении возбудителя в различных видах диагностического материала.

В ответ на распространение мультирезистентного туберкулеза в рамках Партнерства «Остановить ТБ» (Stop TB Partnership) в начале 2000 годов был создан Фонд инновационных методов диагностики — Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), неприбыльную организацию, которая поддерживается Фондом Билла Гейтса, фонда Рокфеллера и другими частными фондами. Эта организация возглавила научные разработки новых методов диагностики туберкулеза, задействовала к этому процессу известных мировых производителей медицинского диагностического оборудования. Существенные денежные вливания в научные разработки и производственный процесс со стороны FIND позволили значительно снизить стоимость новых методов диагностики и сделать их доступными для стран мира с высоким уровнем заболеваемости на туберкулез.

Ускоренные методы диагностики туберкулеза на жидких питательных средах в автоматизированных микробиологических системах.

В начале 2000 годов американская компания Becton Dickinson, которая тесно сотрудничает с FIND, разработала и выпустила на рынок автоматизированную радиометрическую микробиологическую систему для культурального определения МБТ на жидкой среде Миддлбрука — BACTEC 460, которая позволяет диагностировать туберкулез и мультирезистентный туберкулез в более короткие сроки. В этой системе рост МБТ фиксировался автоматически с выделением радиоактивного диоксида углерода, меченного изотопом 14C, при росте микобактерий в среде, которая требует 4-12 дней. Использование радиоактивных изотопов в автоматизированной системе является одним из наиболее существенных недостатков и значительно затрудняет широкое применение этого метода. Поэтому на смену радиометрической системе очень быстро пришла система ВАСТЕС MGIT 960, которая базировалась на новом диагностическом методе с использованием Mycobacteria Growth Indicator Tube. Основным компонентом системы является пробирка с модифицированным бульоном Миддлбрука, который поддерживает рост микобактерий. В силикон на дне пробирки введен флуоресцентный компонент, который чувствителен к присутствию кислорода, что растворен в бульоне. Концентрация растворенного кислорода гасит излучение этого вещества, и обнаруживается лишь незначительная флуоресценция. В дальнейшем активно дышащие микобактерии потребляют кислород, что позволяет наблюдать флуоресценцию вещества. Система BACTEC MGIT 960 расценивает пробирку как положительную, если количество живых микроорганизмов в ней достигла 1000 клеток в 1 мл среды. Прибор осуществляет непрерывный мониторинг пробирок. Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 представляет собой качественный тест, который выполняется в течение 4-42 дней. Прибор предназначен только для обнаружения микобактерий и проведения теста медикаментозной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам І и II ряда (до 21 суток). На сегодня эксперты с микробиологической диагностики туберкулеза признали этот метод «золотым стандартом» диагностики туберкулеза, несмотря на его стандартизацию, которая минимизирует человеческий фактор при приготовлении питательной среды. Исследования с помощью автоматизированной системы повышает вероятность подтверждения диагноза туберкулеза у больных с отрицательным мазком мокроты на 20%. После определения положительного результата необходимо проводить идентификацию микроорганизмов, поскольку фиксируется лишь их рост за потреблением кислорода. К недостаткам метода относится необходимость ручной подготовки проб, что требует строгого соблюдения методики исследования и требований инфекционного контроля по биологической безопасности при проведении исследований. Для непрерывной работы аппарата необходимо бесперебойное электроснабжение. В Украине исследование мокроты в жидкой среде с помощью микробиологической системы ВАСТЕС MGIT 960 является необходимыми составляющими диагностического алгоритма на наличие туберкулеза согласно Унифицированного протокола первичной, вторичной и третичной медицинской помощи «Туберкулез». Исследование доступно во всех регионах Украины. Образцы мокроты из районов каждой области транспортируют в лаборатории микробиологической диагностики III уровня, которая обычно находится в областном противотуберкулезном диспансере. Культуральные исследования на наличие туберкулеза не могут выполняться в частных лабораториях из-за их биологической опасности, необходимость принадлежности к сети микробиологической диагностики туберкулеза с постоянным внешним контролем качества исследований со стороны Центральной референт-лаборатории МЗ Украины, работу которой, в свою очередь, контролирует супранациональная лаборатория, функции которой определяет ВОЗ.

Молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза

Сокращение сроков выявления возбудителя, видовой идентификации и определения лекарственной резистентности микобактерий может быть достигнуто за счет применения в лабораторной практике молекулярно-генотипических методов. Их использование в диагностике туберкулеза позволяет в кратчайшие сроки установить резистентность МБТ к противотуберкулезным препаратам при госпитализации больного в стационар, выявлять микобактерии не туберкулезного комплекса, назначать правильное лечение с самого начала, что повышает эффективность терапии, предотвращает распространение штаммов микобактерий, резистентных к лекарственным средствам. Основой молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая получила широкое распространение для выявления различных инфекционных агентов, в том числе микобактерий. Тесты амплификации нуклеиновых кислот позволяют установить очень небольшое количество микроорганизмов.

Метод дает возможность обнаружить возбудителя даже при наличии лишь десятков или сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала. Принцип метода ПЦР заключается в амплификации — многократном увеличении участков специфической последовательности ДНК микобактерий в пробирковом микрообъеме. Многократное удвоение специфических фрагментов ДНК приводит к увеличению их количества в геометрической прогрессии до уровня, который позволяет осуществить детекцию существующими методами. Результаты ПЦР оценивают с помощью различных методов гибридизации продукта со специфическими комплементарными мечеными ДНК-зондами. При условии оптимального выбора гена для амплификации или нуклеотидной последовательности гена этот метод позволяет с высокой специфичностью идентифицировать возбудителя. Тесты амплификации быстрые и безопасные. Преимуществами метода являются его высокая специфичность (98-100%), скорость (результат за 2,5-3,5 ч), высокая чувствительность у пациентов с положительным мазком мокроты (более 95%), возможность проведения исследования любых биологических материалов. К недостаткам метода относятся сложность интерпретации результатов (требующая специальной подготовки), высокая стоимость, низкая чувствительность у больных с отрицательным мазком мокроты (60-70%). Однако именно сложность интерпретации результатов стала ограничением к его широкому внедрению в клиническую практику.

Немецкая компания Hain Lifescience при поддержке FIND предложила новый, более простой метод молекулярной диагностики туберкулеза и определения мутаций в генах МБТ, ответственных за резистентность к противотуберкулезным препаратам, ВОЗ сейчас рекомендует к внедрению во всем мире, — GenoType MTBDRplus/GenoType MTBD Rsl. Метод базируется на ПЦР с использованием праймеров, меченых биотином, для амплификации фрагмента генов, которые связаны с медикаментозной резистентностью. Далее происходит гибридизация биотин меченых продуктов с ДНК зондами, что иммобилизованные на мембранах, на которых размещены ДНК зонды дикого типа (без мутаций) и ДНК зонды для детекции известных мутаций. Следующий этап — визуализация результатов гибридизации: ДНК М. tuberculosis и мутаций, ассоциированных с резистентностью (цветные полоски на мембранах). Расшифровка мутаций и установление резистентности к противотуберкулезным препаратам осуществляются с помощью компьютера. Преимущества этого метода заключаются прежде всего в простоте технического исполнения (может быть применен в обычных лабораториях), скорости (результат из образца в случае положительного мазка мокроты или из культуры получают через 4-5 ч), безопасности, высокой специфичности (99%), высокой чувствительности при положительном мазке мокроты (до 98%), экономичности (требуется минимальное количество оборудования: центрифуга (13000), вертекс, термостат, термоциклер, термошейкер, блот). К недостаткам метода относится недостаточная чувствительность при отрицательных мазках мокроты, высокая стоимость исследования и необходимость трех дополнительных помещений для проведения анализа. Поэтому сегодня рекомендуется выполнять исследования только у больных с положительным мазком мокроты и из групп риска мультирезистентного туберкулеза независимо от результатов бактериоскопии.

Сегодня в соответствии с рекомендациями ВОЗ в Украине предложено два метода молекулярно-генетической диагностики, которые могут быть использованы для решения вопроса своевременной диагностики туберкулеза, — тест система гибридизации с типоспецифичными зондами GenoType (технология ДНК-стрипов), тест система GeneXpertMTB/RIF. Тест система GeneXpertMTB/RIF рекомендованная ВОЗ при поддержке FIND к использованию в диагностике туберкулеза только с 2010 года. Тест система Gene XpertMTB/RIF является полуколичественной гнездовой ПЦР в реальном времени в картриджи, и ее проводят с целью выявления ДНК МБТ в образцах мокроты или концентрированных осадках мокроты; мутаций резистентности к рифампицину в образцах, полученных от пациентов с риском развития резистентности к этому препарату. GeneXpertMTB/RIF тест система закрытого типа; выделение и амплификацию выполняют в одноразовом картридже, предварительная обработка диагностического материала сводится к минимальным манипуляциям. Это позволяет значительно уменьшить возможность контаминации материала. По данным ВОЗ, резистентность к рифампицину коррелирует с резистентностью к изониазиду. Резистентность к рифампицину и изониазиду (мультирезистентность) обычно свидетельствует о необходимости одновременного проведения полного тестирования на чувствительность к препаратам І и II ряда, но это возможно только после выделения культуры микобактерий. Результат обрабатывают на компьютере и распечатывают (позитивный/негативный, резистентность к рифампицину есть/нет). Преимуществами метода является скорость (весь процесс длится менее 2 ч), высокая специфичность (100%), высокая чувствительность для пациентов с положительным мазком мокроты (98%), простота (необходимый минимальный уровень навыков), отсутствие потребности в отдельных помещениях для проведения ПЦР. К недостаткам метода относятся возможность определения устойчивости возбудителя только к одному противотуберкулезному препарату рифампицину, что предопределяет необходимость дальнейших исследований для диагностирования мультирезистентности; возможность использования только нативной мокроты и концентрированных ее образцов (продолжаются исследования по применению других биологических образцов); высокая стоимость исследований. Учитывая вышеуказанные ограничения метод используется как скрининговый для обследований групп населения с высоким риском мультирезистентного туберкулеза (ранее леченые лица; те, что контактировали с больными мультирезистентным туберкулезом; ВИЧ инфицированные) с целью принятия своевременного решения по изоляции таких пациентов и назначения правильного лечения.

Благодаря инициативам FIND и глобальному распространению указанного метода в мире за последние два года стоимость одного исследования снизилась в 2,5 раза и составляет 5,5 долларов. Тест система GenoType используют только в лабораториях для микробиологической диагностики туберкулеза III уровня, и она предназначена для диагностики туберкулеза с идентификацией микобактерий и определением чувствительности к рифампицину, изониазиду, фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу. Тест-система GenoType предназначена для обследования следующих групп пациентов со строгим соблюдением определенной последовательности и приоритетности. В качестве первичного диагностического теста независимо от результата бактериоскопии на КУБ (положительный и отрицательный мазок):
— ВИЧ инфицированные пациенты с подозрением на туберкулез;
— пациенты с подозрением на легочный туберкулез с риском наличии мультирезистентного туберкулеза (группы риска согласно национальному протоколу);
— лица, которые контактируют с больными мультирезистентным туберкулезом;
— пациенты, которые ранее получали лечение по поводу туберкулеза и которым повторно установлен диагноз легочного туберкулеза (неэффективная терапия, рецидив, отрыв), больные с рецидивом, после неудачи лечения или отрыва при отсутствии в анамнезе данных о резистентность к рифампицину и изониазиду;
— пациенты, которые родились в стране с высоким уровнем заболеваемости; дети-подростки (возрастная группа 0-17 лет) с подозрением на туберкулез.

В качестве вторичного диагностического теста после бактериоскопии на КУБ (положительный мазок):
больные туберкулезом с отрицательной клинико-рентгенологической динамикой и/или продолжением или возобновлением бактериовыделения (с целью ускорения выявления вторичной медикаментозной резистентности МБТ во время лечения);
— пациенты из социальных групп риска, в которых вы явлено легочный туберкулез методом бактериоскопии;
— больные с впервые диагностированным туберкулезом методом бактериоскопии. Для исследования используют исследовательский материал (позитивный образец мокроты, подтвержден бактериоскопически; культура микобактерий, что выросла на жидкой и/или плотной питательной среде).

Тест систему GeneXpertMTB/RIF применяют в Украине в лабораториях с микробиологической диагностики туберкулеза ІІ-ІІІ уровней для быстрого выявления МБТ (без идентификации) и определения устойчивости к рифампицину. Тест система GeneXpertMTB/RIF предназначена для обследования следующих групп пациентов со строгим соблюдением такой последовательности и приоритетности. В качестве первичного диагностического теста независимо от результата бактериоскопии на КУБ (положительный и отрицательный мазок):
— ВИЧ инфицированные пациенты с подозрением на туберкулез;
— пациенты с подозрением на легочный туберкулез с риском наличия мультирезистентного туберкулеза (группы риска согласно национальному протоколу), лица, контактирующие с больными мультирезистентным туберкулезом;
— пациенты, которые ранее получали лечение по поводу туберкулеза и которым повторно установлен диагноз легочного туберкулеза (неэффективная терапия, рецидив, отрыв), больные с рецидивом, после неудачи лечения или отрыва при отсутствии в анамнезе данных об устойчивости к рифампицину;
— пациенты, которые родились в стране с высоким уровнем заболеваемости; дети-подростки (возрастная группа 0 17 лет) с подозрением на туберкулез.

В качестве вторичного диагностического теста после бактериоскопии на КУБ (положительный мазок):
— больные туберкулезом с отрицательной клинико-рентгенологической динамикой и/или продолжением или возобновлением бактериовыделения (с целью ускорения выявления вторичной медикаментозной резистентности МБТ во время лечения);
— пациенты из социальных групп риска, в которых обнаружен легочный туберкулез с помощью метода бактериоскопии;
— больные с впервые диагностированным туберкулезом методом бактериоскопии; пациенты с подозрением на легочный туберкулез, у которых получен отрицательный результат бактериоскопии мазка мокроты, но при наличии клинических симптомов туберкулеза.

Для качественной диагностики и обеспечения достоверности результатов тест системы GeneXpert MTB/RIF необходимо правильно собранный диагностический материал. Пациент должен собирать мокроту обязательно под наблюдением медицинского работника. В случае отсутствия мокроты у детей как исследуемый материал можно использовать промывные воды бронхов или смыв из ротоглотки. Недопустимыми являются примеси пищи или крови в образцах, которые будут восприниматься системой как испорченные. Внедрение в практику здравоохранения молекулярно-генетических методов (GeneXpert MTB/RIF и тест системы гибридизации с типоспецифичными зондами (технология ДНК-стрипов) в сочетании с современными фенотиповыми методами позволит улучшить качество и своевременность диагностики туберкулеза в Украине. Полное оснащение украинских лабораторий этим оборудованием планируется в рамках выполнения Общегосударственной целевой социальной программы противодействия заболеванию туберкулезом на 2012-2016 годы. На сегодня системами GeneXpert MTB/RIF оснащены лаборатории в половине областей Украины. Одновременное использование молекулярно-генетического и культурального методов исследования будет способствовать быстрому установлению диагноза, правильной интерпретации результатов для определения клинического значения выявленных мутаций, ответственных за резистентность к противотуберкулезным препаратам, изоляции пациента и своевременном начале лечения, позволит улучшить клинический результат и повысить экономичность терапии. Очень важным является комбинированное применение этих методов для правильной интерпретации результатов с целью их эффективного использования в клинической практике, что ограничивает применение молекулярно-генетических методов в частных лабораториях.


Уважаемый посетитель, Вы зашли на сайт как незарегистрированный пользователь
Мы рекомендуем Вам зарегистрироваться либо войти на сайт под своим именем.
  Просмотров: 9 236 Отзывов (0) Распечатать

Наша группа ВКонтакте: